PCR

La PCR permite hacer millones de copias de una secuencia blanco conocida, y es la técnica más importante de la Biología Molecular

qPCR

La PCR en tiempo real o PCR cuantitativa es una técnica basada en la PCR que se utiliza para cuantificar la expresión relativa de los genes o la cuantificación absoluta de ácidos nucleicos

ddPCR

Un moderno método de PCR cuantitativo que permite medir las cantidades de ADN y ARN presentes en una muestra

Oxford Nanopore Technologies

Esta tecnología de Oxford Nanopore provee lecturas largas en tiempo real

Plataforma Illumina

Un método de secuenciación masiva paralela con muy alto rendimiento

PacBIO - SMRT

Secuenciación de moléculas largas de ADN en tiempo real

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PCR

Millones de copias de una secuencia de interés en pocas horas.

La PCR estándar es una técnica básica pero poderosa debido a su gran número de aplicaciones.

Entre ellas se encuentran la amplificación de secuencias de ADN o ADNc específicas para su posterior clonación y construcción de bibliotecas o para su secuenciación, el diagnóstico molecular de enfermedades, la selección asistida por marcadores moleculares, entre otras.

Asimismo, la PCR es la base de numerosas técnicas de marcadores moleculares tales como los marcadores microsatélites que se pueden usar para la identificación inequívoca de variedades, la caracterización de colecciones de germoplasma, o estudiar la estabilidad genética de plantas micropropagadas.

La PCR también se puede utilizar para crear mutaciones en determinados genes y estudiar su efecto en el fenotipo.

qPCR

Excelente herramienta para el diagnóstico molecular.

La qPCR se diferencia de la PCR estándar o convencional en su naturaleza cuantitativa.

Por eso es un método muy usado para estimar la expresión relativa de los genes.

Por ejemplo, si desea conocer los niveles de expresión de uno o varios genes específicos en diferentes etapas de desarrollo, órganos o condiciones fisiológicas, esta técnica le puede ser de gran utilidad.

También se puede usar como método de diagnóstico para enfermedades virales, bacterianas y fúngicas.

ddPCR

Moderno método de PCR cuantitativo en tiempo real.

La Droplet Digital PCR es un método similar al qPCR pues usa los mismos componentes de reacción, pero se diferencia en la forma en que se mide la cantidad de producto amplificado en términos absolutos.

En esta técnica, la reacción de PCR se separa en miles de gotas en el orden de nanolitros en una emulsión de agua y aceite de forma tal que en cada gota hay una sola molécula blanco o unas pocas.

Luego un equipo mide cada gota para la presencia (1) o ausencia (0) de señal de fluorescencia, de ahí la denominación de digital, luego con un procesamiento estadístico se determina la cantidad de moléculas de ADN en la muestra.

Esta técnica no sustituye a la qPCR en todas las aplicaciones pero es más apropiada para ciertos estudios como la detección de mutaciones, SNPs, número de copias de un gen dentro de un genoma y para detectar pequeños cambios en la expresión de los genes.

Oxford Nanopore Technologies

Moderna tecnología de secuenciación que permite lecturas largas.

MinION es un dispositivo portable que es capaz de secuenciar genomas completos en tiempo real.

El principio básico de su funcionamiento se basa en pasar una molécula de ácido nucleico por un nanoporo proteico y monitorear los cambios de corriente eléctrica en tiempo real cada vez que pasa una base.

La tecnología Nanopore permite obtener fragmentos mucho más largos que los obtenidos por el resto de las tecnologías de secuenciación, lo que permite un mejor y más fácil ensamblaje de los genomas.

Su capacidad para generar datos en tiempo real permite la identificación instantánea de organismos en muestras complejas (Metagenómica).

Plataforma Illumina

Alto rendimiento y precisión de las lecturas.

Illumina usa un sistema de secuenciación por síntesis de cuatro colores, en el que la incorporación de un nucleótido terminador reversible genera una señal fluorescente detectada por una cámara de alta sensibilidad para cada base.

Ofrece diversas plataformas con diferentes rendimientos como MiniSeq (7.5 Gb), NextSeq (120-300Gb), HiSeq (125-1500 Gb) y NovaSeq 6000 (134–6000 Gb).

Illumina puede generar muchos millones de lecturas con alta precisión lo que la hace más rápida y barata que otros métodos disponibles.

PacBIO - Pacific Biosciences SMRT

Lecturas largas, buen rendimiento.

Esta técnica usa lo que llaman onda de modo cero (ZMW, siglas en inglés), una estructura de confinamiento nanofotónica (aproximadamente de 70 nm de diámetro y 100 nm de profundidad). La secuenciación se hace en un chip que contiene muchos ZMWs. En el fondo de cada uno de estos orificios se fija una ADN polimerasa con una sola molécula de ADN de hebra simple. Cada una de las cuatro bases nitrogenadas del ADN se marca con un fluoróforo diferente. Así, cuando un nucleótido se incorpora a la cadena incipiente, se libera el fluoróforo y se observa una señal que es recogida en un detector.

La gran ventaja de PacBio es su capacidad para producir lecturas largas, lo que la hace muy apropiada para el ensamblaje de novo de genomas. En comparación con Illumina, posee aún un rendimiento inferior y no es muy apropiada para RNA-seq. Estas técnicas se complementan.

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